对于悬浮细胞:离心收集细胞,以2×106细胞为例,在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液,震荡混匀细胞,4℃或冰上裂解30min。08对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样
上午或者是下午都可以打瑞白,可以在医生的建议根据自己的实际情况确定打针时间,因为打完瑞白后常见的副作用有发烧,浑身无力,以及骨痛等,所以为了减少瑞白副作用对日常生活的影响可以选择在晚上打。瑞白有一定的保胎作用,在试管婴儿移植后,适当使用瑞白可以促进胚胎着床,提高试管婴儿成功率。
瑞白有两种注射方式,皮下注射或者是静脉注射,注射时间可以根据自己的身体情况来选择,无论是上午、下午还是晚上都行,需要注意的就是打瑞白一定要在医生的指导下进行,不能随便使用,下面可以了解一下打瑞白的时间、方式以及注意事项:
1.打瑞白常见的副作用有肌肉酸痛,骨痛、腰痛、胸痛等,少见的还会出现食欲不振或肝脏异常的情况,所以为了防止瑞白的副作用对如上生活的影响,可以在下午或者晚上打;
2.瑞白可以选择皮下注射或者是静脉注射,皮下注射通常选择上臂区域或者肚皮进行相关注射;
3.注射时请核对药品名称,有瑞白和新瑞白,两者有区别,不能混淆,非必要情况不要私自注射。
ELISA样本制备指南及注意事项
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1
定义及介绍
ELISA(enzyme linked immunosorbent assay,酶联免疫吸附测定)是最基础的免疫学实验之一,其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本,实验操作步骤并不繁琐,但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值,从而供下一步分析所用,因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。
样本制备指南
1
血清
全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃,1000×g离心20min,取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血,高血脂样品
2.血浆
抗凝剂推荐使用EDTA-Na
2,样品采集后30min内于2-8℃,1000×g离心15min,取上清即可检测。
3组织匀浆/组织全蛋白
用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织,去除残留血液,称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比,比如1g的组织样品对应9mL的PBS,具体体积可根据实验需要适当调整,并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中,在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞,可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃,5000×g离心5-10min,取上清检测。
其余方法:在分析天平(AL204型)上,称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液;并用小剪刀等工具将组织样本剪碎(尽可能小块)。注:1×PBS缓冲液使用前,需加入PMSF,现用现加,PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪,将超声破碎仪的功率调至25%,超声时间2s,间隔时间5s,总时间2min。放入样本,冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后,将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机,将转速调至12000×g;将样本放入离心机,离心10min,取上清,按需要分装,于-20℃贮存。注:留取20μL样本,用于后续BCA法测定样本蛋白含量。
组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要,建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上,较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。
4.细胞提取液
贴壁细胞
用冷的PBS轻轻清洗,然后用胰蛋白酶消化,1000×g离心5min后收集细胞;
悬浮细胞可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10
6个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂;若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃,1500×g离心10min,取上清检测。注:留取20μL样本,用于后续BCA测定。
其余方法:
对于
贴壁细胞:去除培养液,用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例,在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液,震荡混匀细胞,4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下,使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理,超声步骤与组织样本相同。
对于
悬浮细胞:离心收集细胞,以2×10
6细胞为例,在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液,震荡混匀细胞,4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多,必需分装成(5-10)×10
5细胞/管,然后再裂解。必要时可以进行超声处理,超声步骤与组织样本相同。注:1×PBS缓冲液使用前,需加入PMSF,现用现加,PMSF终浓度为1mM。打开离心机,将转速调至12000×g;将样本放入离心机,离心10min,取上清,按需要分装,于-20℃贮存。注:留取20μL样本,用于后续BCA法测定样本蛋白含量。
5.细胞培养上清或其他生物体液
收集液体后于2-8℃,1000×g离心20min,除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注:因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响,不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。
实验细节与注意事项
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1
收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎,释放大量的过氧化物酶,会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)的酶促反应,造成检测结果的不确定性。
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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃,若不能及时检测,请按一次使用量分装,冻存于-20℃(1个月内检测),或-80℃(3个月内检测),避免反复冻融。在检测前,冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。
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3
试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围,建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低,请对样本做适当的稀释或浓缩。
04
检测样本的稀释推荐多步稀释法,常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍;细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍;建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。
对于稀释倍数比较大的检测样本,参考稀释方案如下:
稀释100倍:一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内,做100倍稀释;
稀释1000倍:两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内,做20倍稀释,再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内,做50倍稀释,总共稀释1000倍;
稀释100000倍:三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内,做40倍稀释,再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内,做50倍稀释,最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内,做50倍稀释,总共稀释100000倍;
每步稀释时取液量不少于3μL,稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀,避免起泡。
05
若所检样本不在说明书所列样本之中,建议做预实验验证其检测有效性。
06
若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液,由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。
07
某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。
08
对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本,经BCA法测定样本蛋白含量后,建议进行蛋白浓度的统一化,避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差;例如,统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL,进行后续的稀释和检测。
众所周知,
试管婴儿有三种不同的技术,
试管一代、二代、三代,
但是很大一部分朋友还不知道如何选择,
认为三代试管技术是最好的~
但是,真的是这样吗
?
它们三个之间到底有什么区别呢?
我们一起跟着医生来了解了解~
一代、二代和三代试管婴儿都是辅助生殖技术中的体外受精-胚胎移植技术,相同点是都需要经过控制性卵巢刺激(通俗地讲就是促排卵)、取卵、精卵体外受精和胚胎移植,不同点是适用人群和受精方式的不同,移植胚胎不同,当然还有很重要的一点:
费用不同
。
01>
“第一代”试管婴儿技术:>
体外受精和胚胎移植(IVF-ET)>
第一代试管婴儿即传统的体外受精-胚胎移植,之所以成为第一代是因为这是最先发明出来的一种试管婴儿技术,也是到目前为止应用时间最久的试管婴儿技术,很多第一代试管婴儿技术出生的小孩已经为人父母了。
第一代
试
管婴儿
技术
主要适用于
女性因素导致不孕的状况如输卵管阻塞、排卵障碍、子宫内膜异位症>等,
还有
男性的
轻度少弱精子症,以及不明原因不孕>。
第一代试管婴儿技术需要在超声引导下经阴道穿刺将卵子取出,同时男方手淫取出精液,在实验室环境下让精卵自然结合,看重点:
精卵自然结合>。
02>
“第二代”试管婴儿技术:>
卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)>
第二代试管婴儿绝对是男同胞的福音,主要适用于
男性因素导致的不育>,如严重少弱精子症、梗阻性无精子症以及IVF不受精或受精率低下等。胚胎师通过挑选活力好、形态正常的精子一对一注射到卵母细胞内,使其受精。
在IVF授精后,胚胎师会等4-6小时,再观察卵子,如果没有看到受精标志,就会用第二代ICSI技术帮它们一把。一代和二代试管婴儿的成功率无明显差别。
通过上面的描述,
您发现一代和二代试管婴儿技术的最大区别了吗?
一代试管是精卵自由结合,二代试管是通过显微操作系统将一条精子注射到一个卵子里,一对一人为结合。>
03>
“第三代”试管婴儿技术:>
胚胎植入前遗传学检测(PGT)>
第三代试管婴儿技术适用染色体核型异常,严重的单基因遗传疾病,反复自然流产等特殊状况,很多时候,这个群体是可以自然妊娠的,但妊娠结局不好或出生孩子有缺陷和遗传疾病。第三代试管婴儿的授精方式是一样的。
不同的地方在哪里呢?就是在胚胎移植入子宫之前,
会对其进行遗传学检测>,看看是否携带有染色体疾病或致病基因,把有问题的胚胎淘汰掉,将健康的胚胎放进子宫里。
因此,第一代、第二代和第三代试管婴儿不仅仅是技术上的不同,更主要的是适应不同的人群。
>
哪些情况不能做试管婴儿?
1.男女任何一方患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病。
2.患有《母婴保健法》规定的不宜生育且目前无法进行产前诊断或胚胎植入前遗传学诊断的遗传性疾病。
3.任何一方具有吸毒等不良嗜好。
4.任何一方接触致畸量的射线、毒物、药物并处于作用期。
5.女方子宫不具备妊娠功能或严重躯体疾病不能承受妊娠。
>
在整个治疗过程中,您有任何疑惑都可以和主诊医生、护士沟通,说出您的疑虑,解除您的顾虑,从容顺利完成整个治疗过程!
医学指导
苏宁
副主任医师,
生殖医学硕士
>从事妇产科临床工作10余年,擅长生殖内分泌疾病及多种原因导致的女性不孕症的诊治,熟练开展人工授精、试管婴儿等辅助生殖技术,并能妥善处理相关并发症。
总院门诊时间> :周一至周五全天。 声明:本文文字转载、 广州市第一人民医院 ,如有侵权,请及时告知我们,我们将在最短的时间内删除。
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